培養(yǎng)箱活細(xì)胞增殖熒光觀察是一種借助熒光標(biāo)記技術(shù)和特定設(shè)備，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況的方法。以下是詳細(xì)介紹：

熒光標(biāo)記方法

活細(xì)胞細(xì)胞核探針標(biāo)記：可使用 Hoechst 33342，其激發(fā)波長(zhǎng)為 350nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 461nm，低毒性，在 2-5μg/mL 濃度下可維持 48 小時(shí)，能清晰標(biāo)記細(xì)胞核，便于計(jì)數(shù)分裂細(xì)胞。SiR-DNA 也是常用的探針，其具有遠(yuǎn)紅外熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為 652nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 674nm，光毒性極低，適合 72 小時(shí)以上的長(zhǎng)時(shí)間觀察。

增殖特異性熒光蛋白標(biāo)記：通過基因編輯技術(shù)，如將 Ki67 與 GFP 融合，構(gòu)建 Ki67-GFP 融合蛋白，Ki67 僅在增殖細(xì)胞中表達(dá)，可據(jù)此區(qū)分增殖細(xì)胞和靜息細(xì)胞，直接篩選出增殖細(xì)胞群體。

成像設(shè)備及參數(shù)設(shè)置

集成式培養(yǎng)箱熒光顯微鏡：如賽多利斯 Incucyte SX5，可直接嵌入培養(yǎng)箱內(nèi)，支持 6 個(gè)獨(dú)立板位，兼容 384 孔板，能同時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等 10 余種動(dòng)態(tài)過程。它提供綠色（Ex：440-480nm，Em：504-544nm）、紅色（Ex：565-605nm，Em：625-705nm）等多通道熒光成像，結(jié)合 HD 相差成像，無需取出細(xì)胞即可完成多維度分析。

小型化培養(yǎng)箱內(nèi)熒光顯微鏡：以 CytoSMART Lux3 FL 為代表，體積小巧，可適配不同尺寸培養(yǎng)箱，支持 APP 遠(yuǎn)程監(jiān)控，分辨率達(dá) 1μm，支持 3 通道熒光（藍(lán) / 綠 / 紅），適合藥物篩選和干細(xì)胞分化追蹤等中小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。

成像參數(shù)設(shè)置：以觀察 HeLa 細(xì)胞增殖為例，激發(fā)光強(qiáng)度熒光通道一般≤20%，如 Hoechst 通道激發(fā)光強(qiáng)度可設(shè)置為 10%-15%；曝光時(shí)間熒光通道為 50-200ms，明場(chǎng)通道為 10-50ms；時(shí)間間隔可設(shè)置為 15-30 分鐘 / 次，以完整捕捉細(xì)胞分裂過程；視野數(shù)量方面，96 孔板每孔可拍 3-5 個(gè)視野，覆蓋不同細(xì)胞密度區(qū)域。

數(shù)據(jù)分析

圖像預(yù)處理：常用工具包括 Incucyte Analysis Software、ImageJ（Fiji）等。通過背景扣除，如使用 Fiji 的 “滾動(dòng)球背景扣除" 功能，去除培養(yǎng)皿背景熒光；運(yùn)用 “高斯濾波" 消除隨機(jī)噪音，避免誤判為細(xì)胞；設(shè)置固定閾值進(jìn)行閾值分割，將細(xì)胞核轉(zhuǎn)化為黑白二值圖像，便于自動(dòng)計(jì)數(shù)。

增殖指標(biāo)計(jì)算：通過計(jì)數(shù)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞核數(shù)量，結(jié)合時(shí)間維度，可提取細(xì)胞總數(shù)增長(zhǎng)曲線、增殖倍數(shù)等關(guān)鍵增殖指標(biāo)，反映細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)規(guī)律。