小鼠樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cells, DCs）的熒光觀察是研究其成熟、抗原攝取與呈遞、遷移及免疫激活功能的重要手段。以下從樣本制備、熒光標(biāo)記策略、成像技術(shù)選擇、實(shí)驗(yàn)優(yōu)化要點(diǎn)及典型應(yīng)用場(chǎng)景五個(gè)方面，系統(tǒng)闡述小鼠DC細(xì)胞熒光觀察的關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)：

一、樣本制備：高活性DC細(xì)胞的獲取

小鼠DC細(xì)胞來源

骨髓來源DC（BMDC）：

步驟：取6-8周齡C57BL/6小鼠股骨/脛骨，用RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，離心后重懸于含GM-CSF（20 ng/mL）和IL-4（10 ng/mL）的培養(yǎng)基中，第3天半量換液，第6天收集非貼壁細(xì)胞（純度>80%）。

優(yōu)勢(shì)：易獲取、分化狀態(tài)可控，適合研究DC成熟與功能調(diào)控。

脾臟來源DC：

步驟：機(jī)械研磨脾臟，通過密度梯度離心（如Percoll）分離低密度細(xì)胞，再用CD11c?磁珠分選（純度>90%）。

優(yōu)勢(shì)：更接近體內(nèi)成熟狀態(tài)，適合研究天然免疫應(yīng)答。

細(xì)胞活性保障

低溫操作：所有步驟在冰上或4℃進(jìn)行，避免酶活性喪失。

無血清培養(yǎng)基：使用X-VIVO 15或AIM V等無血清培養(yǎng)基，減少血清成分對(duì)熒光標(biāo)記的干擾。

密度控制：接種密度為1×10? cells/mL，避免過度擁擠導(dǎo)致細(xì)胞自分泌因子抑制活性。

二、熒光標(biāo)記策略：靶向DC功能關(guān)鍵分子

根據(jù)觀察目標(biāo)選擇特異性標(biāo)記物，需兼顧信號(hào)強(qiáng)度與功能影響：

觀察目標(biāo)熒光標(biāo)記物標(biāo)記方法應(yīng)用場(chǎng)景

成熟狀態(tài)CD80-FITC、CD86-PE、MHC II-APC抗體直接標(biāo)記（流式/成像）評(píng)估TLR配體（如LPS）誘導(dǎo)的DC成熟

抗原攝取Dextran-Alexa Fluor 48837℃孵育30分鐘（內(nèi)吞途徑標(biāo)記）追蹤DC吞噬凋亡細(xì)胞或顆?？乖?/p>

遷移能力CellTracker Green CMFDA終濃度5 μM，37℃孵育15分鐘活細(xì)胞遷移軌跡追蹤（Transwell）

細(xì)胞骨架Phalloidin-iFluor 555固定后標(biāo)記（4% PFA，15分鐘）分析DC偽足形成與形態(tài)變化

細(xì)胞器動(dòng)態(tài)MitoTracker Red CMXRos活細(xì)胞標(biāo)記（終濃度200 nM，30分鐘）監(jiān)測(cè)線粒體膜電位與能量代謝

信號(hào)通路激活NF-κB-GFP轉(zhuǎn)染慢病毒轉(zhuǎn)染（MOI=10）實(shí)時(shí)觀察TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)動(dòng)態(tài)

三、成像技術(shù)選擇：平衡分辨率與細(xì)胞活性

寬場(chǎng)熒光顯微鏡

適用場(chǎng)景：快速篩查大量細(xì)胞（如96孔板中DC成熟狀態(tài)）。

參數(shù)設(shè)置：

曝光時(shí)間：100-500 ms（根據(jù)熒光強(qiáng)度調(diào)整）。

濾光片：選擇與熒光標(biāo)記物匹配的激發(fā)/發(fā)射波長（如FITC：Ex 488 nm, Em 525 nm）。

圖像拼接：使用20×物鏡掃描整個(gè)培養(yǎng)皿，拼接高分辨率全景圖。

共聚焦顯微鏡

適用場(chǎng)景：三維結(jié)構(gòu)分析（如DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)中的突觸形成）。

參數(shù)設(shè)置：

激光功率：<5%（避免光毒性）。

針孔大?。? Airy單位（平衡分辨率與信噪比）。

Z軸步進(jìn)：0.5 μm（覆蓋DC偽足高度）。

活細(xì)胞工作站

適用場(chǎng)景：長時(shí)間動(dòng)態(tài)追蹤（如DC遷移軌跡或抗原處理過程）。

關(guān)鍵配置：

環(huán)境控制：37℃、5% CO?、飽和濕度。

成像頻率：每5-30分鐘一次（根據(jù)動(dòng)態(tài)過程快慢調(diào)整）。

防漂移設(shè)計(jì)：使用硬件自動(dòng)聚焦（如Perfect Focus System）。

四、實(shí)驗(yàn)優(yōu)化要點(diǎn)：減少干擾與提高可重復(fù)性

降低自發(fā)熒光

培養(yǎng)基選擇：避免使用酚紅（含苯酚紅培養(yǎng)基在488 nm激發(fā)下產(chǎn)生強(qiáng)熒光），改用無酚紅RPMI-1640。

耗材處理：使用低自發(fā)熒光玻璃底培養(yǎng)皿（如Corning 35 mm #1.5 coverglass），避免塑料底干擾。

標(biāo)記條件優(yōu)化

抗體濃度：通過滴定實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度（如CD80-FITC：1 μg/10? cells）。

標(biāo)記時(shí)間：抗體標(biāo)記需在冰上進(jìn)行（減少內(nèi)吞導(dǎo)致的非特異性結(jié)合），細(xì)胞器探針需在37℃標(biāo)記（確保探針進(jìn)入活細(xì)胞）。

數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

陰性對(duì)照：設(shè)置未標(biāo)記組（背景熒光）和同型抗體對(duì)照組（非特異性結(jié)合）。

陽性對(duì)照：使用已知陽性細(xì)胞（如LPS刺激后的DC）驗(yàn)證標(biāo)記有效性。

重復(fù)驗(yàn)證：至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

五、典型應(yīng)用場(chǎng)景與案例

DC成熟與抗原呈遞研究

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

分組：未處理組、LPS（100 ng/mL）刺激組、CpG ODN（1 μM）刺激組。

標(biāo)記：CD80-FITC（成熟標(biāo)志）、MHC II-APC（抗原呈遞能力）、Dextran-Alexa Fluor 488（抗原攝?。?/p>

成像：共聚焦顯微鏡觀察DC表面標(biāo)志物表達(dá)與抗原內(nèi)吞共定位。

結(jié)果分析：LPS組CD80?MHC II?細(xì)胞比例顯著升高，Dextran熒光強(qiáng)度增加，表明DC成熟增強(qiáng)且抗原攝取能力提升。

DC-T細(xì)胞免疫突觸形成

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

共培養(yǎng)：OT-II T細(xì)胞（CD4-CFSE標(biāo)記）與OVA???????肽負(fù)載的DC（MHC II-PE標(biāo)記）。

標(biāo)記：Phalloidin-iFluor 555（細(xì)胞骨架）、p-ZAP70-Alexa Fluor 647（T細(xì)胞活化信號(hào)）。

成像：活細(xì)胞工作站動(dòng)態(tài)追蹤免疫突觸形成過程（時(shí)間間隔5分鐘，總時(shí)長2小時(shí)）。

結(jié)果分析：DC偽足與T細(xì)胞接觸后，p-ZAP70在接觸區(qū)聚集，表明免疫突觸成功形成。

DC遷移與腫瘤免疫逃逸

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

模型：將GFP標(biāo)記的B16F10黑色素瘤細(xì)胞接種于小鼠耳部，局部注射CFSE標(biāo)記的BMDC。

標(biāo)記：CellTracker Red CMPTX（DC遷移追蹤）、Lyve-1-Alexa Fluor 647（淋巴管標(biāo)記）。

成像：雙光子顯微鏡活體觀察DC向腫瘤引流淋巴結(jié)的遷移路徑。

結(jié)果分析：腫瘤微環(huán)境抑制DC遷移速度（遷移距離縮短30%），且部分DC滯留在腫瘤組織內(nèi)，解釋腫瘤免疫逃逸機(jī)制。