在培養(yǎng)箱內(nèi)通過時(shí)間序列熒光顯微觀察活細(xì)胞增殖過程，核心是在維持細(xì)胞生理活性的前提下，通過 “特異性熒光標(biāo)記 + 自動化長時(shí)程成像 + 定量分析"，動態(tài)捕捉細(xì)胞從 G1 期到分裂為兩個(gè)子細(xì)胞的完整周期，同時(shí)避免環(huán)境波動（溫度、CO?）和光毒性對增殖的干擾。以下從技術(shù)體系構(gòu)建、實(shí)驗(yàn)操作流程、數(shù)據(jù)定量方法及關(guān)鍵注意事項(xiàng)展開，提供可落地的研究方案：

一、核心技術(shù)體系：適配 “培養(yǎng)箱內(nèi)" 與 “活細(xì)胞增殖" 的特殊需求

細(xì)胞增殖是連續(xù)的動態(tài)過程（如 HeLa 細(xì)胞周期約 24 小時(shí)），且對環(huán)境敏感（溫度波動 ±1℃即可影響周期進(jìn)程），需針對性解決 “環(huán)境穩(wěn)定性"“標(biāo)記特異性"“成像低損傷" 三大核心問題，技術(shù)選型如下：

技術(shù)模塊核心需求推薦方案關(guān)鍵優(yōu)勢

培養(yǎng)箱內(nèi)成像系統(tǒng)1. 嵌入培養(yǎng)箱，維持 37℃、5% CO?、高濕度；

2. 自動化定時(shí)成像，減少人為干擾；

3. 兼容熒光與明場，滿足增殖觀察1. 專用培養(yǎng)箱內(nèi)成像儀：如 Incucyte SX5、JuLI Br；

2. 定制化顯微鏡 + 培養(yǎng)艙：普通倒置熒光顯微鏡搭配恒溫 / 恒 CO?密閉艙（如 Tokai Hit 培養(yǎng)艙）1. 無環(huán)境波動，細(xì)胞增殖狀態(tài)更接近生理水平；

2. 支持 72-120 小時(shí)連續(xù)成像，覆蓋多代細(xì)胞增殖；

3. 低振動設(shè)計(jì)，避免成像漂移

細(xì)胞增殖熒光標(biāo)記1. 標(biāo)記細(xì)胞核（區(qū)分單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)增殖數(shù)量）；

2. 無毒性 / 低毒性，不影響細(xì)胞周期；

3. 熒光穩(wěn)定，適配長時(shí)程觀察1. 活細(xì)胞細(xì)胞核探針：Hoechst 33342（激發(fā) 350nm，發(fā)射 461nm，低毒性，2-5μg/mL 濃度可維持 48 小時(shí)）、SiR-DNA（遠(yuǎn)紅外熒光，激發(fā) 652nm，發(fā)射 674nm，光毒性極低，適合 72 小時(shí)以上觀察）；

2. 增殖特異性熒光蛋白：基因編輯細(xì)胞（如 Ki67-GFP，Ki67 僅在增殖細(xì)胞中表達(dá)，可區(qū)分增殖 / 靜息細(xì)胞）1. 細(xì)胞核標(biāo)記清晰，便于計(jì)數(shù)分裂細(xì)胞；

2. 遠(yuǎn)紅外熒光（如 SiR-DNA）可減少光毒性，適合長期追蹤；

3. 增殖特異性標(biāo)記（Ki67-GFP）可直接篩選增殖細(xì)胞群體

長時(shí)程成像參數(shù)1. 低光劑量，避免光毒性導(dǎo)致增殖停滯；

2. 合適時(shí)間間隔，完整捕捉分裂過程；

3. 足夠視野數(shù)量，保證統(tǒng)計(jì)可靠性1. 激發(fā)光強(qiáng)度：熒光通道≤20%（如 Hoechst 通道激發(fā)光強(qiáng)度 10%-15%）；

2. 曝光時(shí)間：熒光通道 50-200ms，明場通道 10-50ms；

3. 時(shí)間間隔：15-30 分鐘 / 次（短于細(xì)胞分裂時(shí)長，避免漏拍分裂過程）；

4. 視野數(shù)量：96 孔板每孔拍 3-5 個(gè)視野，覆蓋不同細(xì)胞密度區(qū)域1. 光毒性降至低，細(xì)胞增殖率與常規(guī)培養(yǎng)無差異；

2. 每 24 小時(shí)可獲取 48-96 張圖像，完整記錄細(xì)胞從間期到分裂的動態(tài)；

3. 多視野數(shù)據(jù)減少抽樣誤差，統(tǒng)計(jì)結(jié)果更可靠

二、實(shí)驗(yàn)操作流程：從細(xì)胞準(zhǔn)備到成像啟動的完整步驟

以 “96 孔板培養(yǎng) HeLa 細(xì)胞，用 Hoechst 33342 標(biāo)記，培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù) 72 小時(shí)觀察增殖" 為例，詳細(xì)流程如下：

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：確保初始狀態(tài)一致，減少實(shí)驗(yàn)問題

細(xì)胞接種：

選擇對數(shù)生長期的 HeLa 細(xì)胞（增殖活性穩(wěn)定），用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整濃度至5×103-1×10? cells / 孔（96 孔板，每孔加 100μL 培養(yǎng)基）；

接種后將 96 孔板放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱，靜置 24 小時(shí)（讓細(xì)胞貼壁并恢復(fù)活性，避免初始狀態(tài)波動影響增殖）。

熒光標(biāo)記：

配制2×Hoechst 33342 工作液（用培養(yǎng)基稀釋，終濃度 2μg/mL，避免濃度過高導(dǎo)致細(xì)胞毒性）；

每孔吸棄 50μL 舊培養(yǎng)基，加入 50μL 2× 工作液，輕輕吹打混勻，放回培養(yǎng)箱孵育 30 分鐘（確保細(xì)胞核充分染色）；

孵育后無需洗去多余探針（Hoechst 33342 可在細(xì)胞內(nèi)維持 48-72 小時(shí)，且低濃度下無明顯毒性），直接轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱內(nèi)成像系統(tǒng)。

2. 成像系統(tǒng)設(shè)置：平衡成像質(zhì)量與細(xì)胞保護(hù)

以 Incucyte SX5 為例，參數(shù)設(shè)置需圍繞 “低光損傷" 和 “動態(tài)捕捉" 優(yōu)化：

通道選擇：同時(shí)開啟 “明場"（觀察細(xì)胞形態(tài)，輔助判斷細(xì)胞活性）和 “藍(lán)色熒光通道"（Hoechst 33342，標(biāo)記細(xì)胞核）；

成像參數(shù)：

明場：曝光時(shí)間 15ms，增益 1.0（避免強(qiáng)光照射）；

藍(lán)色熒光：激發(fā)光強(qiáng)度 12%，曝光時(shí)間 100ms，增益 1.2（信號清晰且光劑量低）；

時(shí)間序列設(shè)置：

時(shí)間間隔：20 分鐘 / 次（HeLa 細(xì)胞分裂約 18-24 小時(shí)，20 分鐘間隔可完整記錄分裂的 “核膜消失→染色體分離→核膜重建" 過程）；

總時(shí)長：72 小時(shí)（覆蓋 3 代細(xì)胞增殖，觀察增殖速率變化）；

視野選擇：每孔選擇 4 個(gè)視野（孔的中心 + 四周各 1 個(gè)，避免邊緣效應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞密度不均），確保每個(gè)視野初始細(xì)胞數(shù)約 20-30 個(gè)（便于統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)）。

3. 成像啟動與實(shí)時(shí)監(jiān)控：及時(shí)排除異常

啟動成像后，前 3 個(gè)循環(huán)（1 小時(shí)內(nèi)）需實(shí)時(shí)查看圖像：

明場圖像：細(xì)胞貼壁良好，無皺縮、漂?。ㄅ懦臃N或標(biāo)記導(dǎo)致的細(xì)胞損傷）；

熒光圖像：細(xì)胞核染色均勻，無明顯背景噪音（若背景高，可適當(dāng)降低增益或更換新鮮培養(yǎng)基）；

若發(fā)現(xiàn)部分視野細(xì)胞密度過高（可能導(dǎo)致后期重疊，影響計(jì)數(shù)），可補(bǔ)充設(shè)置低細(xì)胞密度孔的成像（如初始接種 3×103 cells / 孔）；

成像過程中無需打開培養(yǎng)箱（系統(tǒng)自動完成），避免環(huán)境波動影響增殖。

三、數(shù)據(jù)定量分析：從圖像到增殖指標(biāo)的轉(zhuǎn)化

72 小時(shí)成像會生成大量時(shí)間序列圖像（如 96 孔板 ×4 視野 ×216 次循環(huán) = 82944 張圖像），需通過 “圖像預(yù)處理→細(xì)胞計(jì)數(shù)→增殖參數(shù)計(jì)算" 三步解析，常用工具包括Incucyte Analysis Software（自帶）、ImageJ（Fiji）（開源，需安裝 “Cell Counter" 插件）。

1. 圖像預(yù)處理：消除干擾，統(tǒng)一數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

背景扣除：針對熒光通道，用 “滾動球背景扣除"（Fiji：Process→Subtract Background，滾動球半徑 50 像素）去除培養(yǎng)皿背景熒光，確保僅細(xì)胞核信號被計(jì)數(shù)；

去噪：用 “高斯濾波"（Fiji：Process→Filters→Gaussian Blur，sigma=1.0 像素）消除隨機(jī)噪音，避免誤判為細(xì)胞；

閾值分割：熒光通道設(shè)置固定閾值（如基于初始時(shí)間點(diǎn)的陰性對照孔，確定 “細(xì)胞核信號 - 背景" 的分界值），將細(xì)胞核轉(zhuǎn)化為黑白二值圖像（便于自動計(jì)數(shù)）。

2. 核心增殖指標(biāo)計(jì)算：量化增殖效率與動態(tài)

通過計(jì)數(shù)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞核數(shù)量，結(jié)合時(shí)間維度，提取關(guān)鍵增殖指標(biāo)，反映細(xì)胞增殖的動態(tài)規(guī)律：

增殖指標(biāo)定義計(jì)算方法生物學(xué)意義

細(xì)胞總數(shù)增長曲線不同時(shí)間點(diǎn)的總細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化每個(gè)時(shí)間點(diǎn)（如 0h、24h、48h、72h）統(tǒng)計(jì)所有視野的細(xì)胞核總數(shù)，繪制 “細(xì)胞數(shù) - 時(shí)間" 曲線直觀反映增殖趨勢（如對數(shù)期、平臺期的出現(xiàn)時(shí)間）

增殖倍數(shù)某時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)與初始時(shí)間點(diǎn)的比值增殖倍數(shù) =（t 時(shí)刻細(xì)胞數(shù)）/（0h 時(shí)刻細(xì)胞數(shù)）量化整體增殖效率（如 72h 增殖倍數(shù) = 5.0，代表 5 倍增長）

群體倍增時(shí)間（PDT）細(xì)胞總數(shù)翻倍所需的時(shí)間基于對數(shù)期數(shù)據(jù)（如 24h-48h），用公式：PDT = (t2 - t1) × log2 / (logN2 - logN1)（N1=t1 時(shí)刻細(xì)胞數(shù)，N2=t2 時(shí)刻細(xì)胞數(shù)）比較不同組（如對照組 vs 藥物處理組）的增殖速率（PDT 越短，增殖越快）

分裂率單位時(shí)間內(nèi)發(fā)生分裂的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例手動或自動追蹤細(xì)胞核分裂事件（如 1 個(gè)細(xì)胞核分裂為 2 個(gè)），分裂率 =（分裂細(xì)胞數(shù)）/（總細(xì)胞數(shù)）×100%反映細(xì)胞進(jìn)入分裂期的比例（如分裂率下降，提示增殖受抑制）

細(xì)胞周期時(shí)長單個(gè)細(xì)胞從一次分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束的時(shí)間用 “細(xì)胞追蹤" 功能（如 Incucyte 的 “Cell Tracking" 模塊）標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞，記錄其兩次分裂的時(shí)間差，統(tǒng)計(jì)多個(gè)細(xì)胞的平均值分析單個(gè)細(xì)胞層面的周期異質(zhì)性（如部分細(xì)胞周期延長，可能提示應(yīng)激）

3. 結(jié)果可視化：清晰呈現(xiàn)增殖動態(tài)

增長曲線：用 GraphPad Prism 繪制 “細(xì)胞總數(shù) - 時(shí)間" 折線圖（帶誤差線，每組 3 個(gè)復(fù)孔），標(biāo)注對數(shù)期、平臺期的區(qū)間；

分裂動態(tài)視頻：將單個(gè)視野的時(shí)間序列圖像合成為視頻（Fiji：Image→Stacks→Make Movie），直觀展示細(xì)胞從單個(gè)分裂為多個(gè)的過程（如細(xì)胞核先變大、再分裂為兩個(gè)）；

熱圖：用 Excel 或 Origin 繪制 “不同時(shí)間點(diǎn) - 不同孔的增殖倍數(shù)熱圖"，快速對比多組（如不同藥物濃度）的增殖差異。

四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)：避免實(shí)驗(yàn)誤差與細(xì)胞損傷

熒光標(biāo)記的毒性控制：

Hoechst 33342 終濃度需≤5μg/mL（濃度過高會抑制 DNA 復(fù)制，導(dǎo)致增殖停滯），且成像時(shí)藍(lán)色激發(fā)光強(qiáng)度≤15%（避免光毒性疊加）；

若需觀察超過 72 小時(shí)，優(yōu)先選擇 SiR-DNA（遠(yuǎn)紅外熒光，光毒性遠(yuǎn)低于 Hoechst），或采用 “脈沖標(biāo)記"（如每天孵育 30 分鐘后洗去，減少探針積累）。

環(huán)境穩(wěn)定性維護(hù)：

培養(yǎng)箱內(nèi)成像系統(tǒng)需定期校準(zhǔn)溫度和 CO?濃度，避免因環(huán)境波動導(dǎo)致增殖速率異常；

96 孔板需用封口膜密封（僅留透氣孔），防止培養(yǎng)基蒸發(fā)導(dǎo)致滲透壓升高（尤其 72 小時(shí)以上成像）。

數(shù)據(jù)可靠性驗(yàn)證：

每組實(shí)驗(yàn)至少 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)（不同批次細(xì)胞），每個(gè)重復(fù) 3 個(gè)技術(shù)重復(fù)（同批次不同孔），避免單次實(shí)驗(yàn)誤差；

計(jì)數(shù)時(shí)需排除 “細(xì)胞重疊" 干擾（如用 ImageJ 的 “Watershed" 功能分割重疊細(xì)胞核），或選擇初始細(xì)胞密度較低的視野（避免后期重疊）。

細(xì)胞活性監(jiān)控：

結(jié)合明場圖像判斷細(xì)胞活性（若細(xì)胞皺縮、變圓，即使細(xì)胞核存在，也需排除在增殖計(jì)數(shù)外）；

可額外添加 “活細(xì)胞熒光探針"（如 Calcein-AM，綠色熒光標(biāo)記活細(xì)胞），同時(shí)監(jiān)控活性與增殖，確保計(jì)數(shù)的是活細(xì)胞。

五、典型應(yīng)用場景

藥物增殖抑制篩選：觀察不同濃度化療藥物（如順鉑）對腫瘤細(xì)胞（如 A549）增殖的影響，計(jì)算 PDT 和分裂率，篩選最佳抑制濃度；

干細(xì)胞增殖分化研究：觀察間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）在不同誘導(dǎo)條件下的增殖速率變化（如成骨誘導(dǎo)時(shí)增殖是否減慢），結(jié)合分化標(biāo)志物熒光標(biāo)記，關(guān)聯(lián)增殖與分化；

病毒感染對增殖的影響：觀察新冠病毒感染 Vero 細(xì)胞后，細(xì)胞增殖是否停滯（如計(jì)算感染后 24h、48h 的增殖倍數(shù)，與未感染組對比）。

綜上，培養(yǎng)箱內(nèi)時(shí)間序列熒光顯微觀察活細(xì)胞增殖，核心是 “穩(wěn)定環(huán)境 + 低毒標(biāo)記 + 定量分析" 的結(jié)合。通過精準(zhǔn)控制實(shí)驗(yàn)條件和優(yōu)化數(shù)據(jù)分析，可客觀反映細(xì)胞增殖的動態(tài)規(guī)律，為細(xì)胞生物學(xué)研究、藥物篩選等提供可靠的動態(tài)觀測證據(jù)。